Informations

Pourquoi l'absorption (à 260 nm) de l'ADNsb augmente-t-elle avec la température ?

Pourquoi l'absorption (à 260 nm) de l'ADNsb augmente-t-elle avec la température ?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Dans le graphique ci-dessous, je comprends pourquoi A260 de l'ADN double brin augmenterait avec l'augmentation de la température, car plus d'ADN devient simple brin (et A260 de l'ADN simple brin est supérieur à celui de l'ADN double brin car les bases aromatiques sont plus exposées, qui absorbent la lumière ).

Cependant, je ne comprends pas pourquoi l'absorbance de l'ADN ss augmente également… Je sais que les nucléotides individuels absorbent également plus que l'ADN ss (comme indiqué dans "inégalité" ci-dessous), mais je doute que les liaisons covalentes retenant les nucléotides se brisent à 80 degrés centigrades . Serait-ce peut-être l'effet d'une augmentation de la température augmentant l'absorption ? (J'ai lu que l'augmentation de la température augmente la collision des photons et augmente donc l'absorbance, mais je ne suis pas tout à fait sûr). Merci.

« inégalité » montrant qui a le A260 le plus élevé :

nucléotides simples > ssDNA/ssRNA > dsDNA


Il semble que l'intuition du canadien soit correcte --

L'empilement de base se produit toujours dans ssDNA, donc je suppose que c'est pourquoi vous voyez une dépendance à la température

-- sur la base de cet article :

Changements conformationnels de l'ADN simple brin en fonction de la température par SANS

Motivation --

La mesure basée sur l'absorption UV de la température de fusion de l'ADN repose sur l'hypothèse que le duplex d'ADN se dissocie en les mêmes conformations aléatoires d'ADN simple brin (ADNsb) à toutes les températures. Cependant, des études de calorimétrie (citations 2 et 3 citées ci-dessous) ont suggéré que des changements conformationnels dépendant de la température se produisent également dans l'ADNsb.

Les premiers résultats d'études calorimétriques sur la dissociation d'un duplex d'ADN 13-mer ont cependant montré que la conformation de l'unique ADNsb complémentaire dépend de la température (2). Cela était évident dans la différence absolue entre la chaleur de dissociation d'un duplex d'ADN 13-mère de 490 kJ mol−1 déterminé à 74°C déterminé à partir de mesures au calorimètre différentiel à balayage (DSC) et de la chaleur d'association du duplex de -236 kJ mol−1 directement déterminé à 25°C à partir de mesures de calorimétrie discontinue (2). Cette différence a été attribuée aux contributions thermodynamiques supplémentaires des changements de conformation des brins simples complémentaires impliqués par les changements d'absorption UV lors du chauffage des solutions de chacun des brins complémentaires de 25°C à 74°C.

Des résultats plus récents montrent également une grande disparité entre les énergies libres de dissociation des duplex 10-mères extrapolées à partir de mesures DSC à haute température jusqu'à 25°C et les énergies libres déterminées directement à partir de mesures calorimétriques de titrage isotherme sur la liaison des simples brins de le duplex à cette température (3). Cela a de nouveau été attribué aux contributions d'énergie libre du changement dans les conformations de bobines aléatoires à simple brin lorsque la température a augmenté de 25°C à la température de fusion du duplex (3).

Méthodes --

Les auteurs ont utilisé une solution 2 µM d'ADNsb 10-mer (5'-ATGCTGATGC-3') dans du tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 7,0, contenant 0,1 M de chlorure de sodium et 0,1 mM d'éthylènediaminetétraacétate. Les changements dépendants de la température de cette solution ont été mesurés par trois méthodes :

  1. Diffusion des neutrons aux petits angles (SANS) par incréments de 10°C de 25°C à 80°C. Des données de diffusion normalisées ont été utilisées pour calculer la géométrie de l'ADNsb à l'aide de l'algorithme LORES (PDF).
  2. Mesures de densité optique (260 nm) entre 20°C et 90°C, avec une vitesse de chauffe de 1 K par minute et des mesures toutes les 30 secondes.
  3. Calorimétrie différentielle à balayage avec mesures en continu de 5°C à 105°C à 1°C par minute.

Constatations et conclusion --

Prises ensemble, les données SANS et calorimétriques suggèrent que le changement de forme de l'ADNsb avec l'augmentation de la température est dû à un dépilage des bases, correspondant à une transition endothermique.

… [l'ADN ss] subit une expansion dans le sens du diamètre qui provoque une longueur légèrement raccourcie lorsque la température augmente de 25°C à 43°C. Ensuite, à mesure que la température augmente de 43 °C à 53 °C, elle se dilate dans le sens de la longueur à mesure que le diamètre diminue. Enfin, l'ADNsb augmente considérablement à la fois en longueur et en diamètre à mesure que la température augmente encore de 53 °C à 80 °C.

Ces changements conformationnels correspondent au dépilage des purines A et G ainsi que des pyrimidines T et C en 5'-ATGCTGATGC-3' au fur et à mesure de l'augmentation de la température. Le dépilage se manifeste par un mouvement moléculaire des nucléotides dans et hors de l'axe cylindrique (augmentation du diamètre) et par l'étirement de l'hélice ou du cylindre (augmentation du pas). L'augmentation de la densité optique lors de la fusion du simple brin confirme les résultats SANS puisque les changements de densité optique indiquent une exposition des bases puriques et pyrimidiques à un environnement plus polaire (eau).

Et, comme pour la figure de Liliae, les résultats du balayage d'absorbance ultraviolette montrent que la densité augmente avec l'augmentation de la température.


Figure 6. Balayage UVM normalisé d'une solution d'ADNsb à 2 M. La ligne continue est l'ajustement par les moindres carrés d'un modèle de transition A↔B à deux états aux points de données. Les lignes horizontales en pointillés sont les lignes de base extrapolées avant et après la transition et la ligne verticale en pointillés indique la température au milieu de la transition.


Hyperchromicité

L'hyperchromicité associée à la transition plié à simple brin d'un acide nucléique a longtemps été utilisée comme moyen de mesure de la stabilité de la structure secondaire. Cette technique a servi de base à la détermination des paramètres biophysiques du plus proche voisin utilisés couramment dans les laboratoires de biologie moléculaire pour T M prédiction de, par exemple, des amorces PCR (SantaLucia, Allawi, & Seneviratne, 1996 Schroeder & Turner, 2009). En règle générale, cette technique est réalisée en plaçant un échantillon d'ADN dans une cuvette en quartz, qui est maintenue dans un support à température contrôlée, avec un contrôle de température bidirectionnel effectué via un dispositif à effet Peltier. L'absorbance de l'échantillon est généralement contrôlée à 260 nm, car il s'agit de la longueur d'onde à laquelle un brin d'ADN ou d'ARN à séquence mixte présente généralement une absorbance maximale (Fig. 1 A Puglisi et Tinoco, 1989).

Fig. 1 . Fusions contrôlées UV-visible du complexe ADN-bromure d'éthidium. Un duplex d'ADN de 40 pb complexé avec du bromure d'éthidium à la stoechiométrie du voisin le plus proche a été soumis à une dénaturation thermique. L'extraction d'une courbe de fusion à la fois à la longueur d'onde associée à l'ADN (260 nm, (A)) et à la longueur d'onde associée au ligand (460 nm, (B)) démontre que la transition de fusion peut être surveillée aux deux longueurs d'onde. Les données proviennent de la première trace de refroidissement. Les échantillons étaient dans 100 mM de Tris-HCl pH 8, 100 mM de KCl, 10 mM de MgCl2.

Ce n'est pas toujours le cas, cependant—les acides nucléiques contenant le G-quadruplex, par exemple, présentent typiquement un changement minimal d'absorbance à 260 nm. Ces structures présentent hypochromisme avec une température croissante à 295 nm ( Mergny & Lacroix, 2009 ). Dans le cas d'acides nucléiques en complexe avec un ligand, comme un médicament stabilisant la structure secondaire, ou un colorant fluorogène, une autre longueur d'onde est souvent souhaitée ( Dolgosheina et al., 2014 Paige, Wu, & Jaffrey, 2011 Waring, 1965 ) . Cela peut être une longueur d'onde visible associée au colorant, ou une autre longueur d'onde UV, avec le A260 transition obscurcie ou décalée en raison de l'absorbance du ligand (Fig. 1 B).

Nous avons trouvé que la longueur d'onde optimale pour observer une transition de structure secondaire est souvent déterminée de manière empirique. Ainsi, nous avons trouvé utile de collecter le spectre d'absorbance complet des échantillons à chaque température, permettant une analyse ultérieure des données. Nous avons découvert que la plupart des instruments disponibles dans le commerce ont la possibilité de collecter une seule longueur d'onde ou quelques longueurs d'onde discrètes. Il existe un instrument à barrette de diodes qui collecte des spectres complets (l'Agilent 8453/8454) avec un support Peltier, mais uniquement dans un format de cellule unique. L'Agilent Cary 60 est l'un des spectromètres UV-visible à cuvette les moins chers disponibles (environ 11 000 $ nouveau à partir de 2017), mais il est unique en ce qu'il utilise une source de lampe flash avec un taux de répétition de 80 Hz, permettant de numériser un UV complet. spectre visible en quelques secondes. Il n'a pas de module Peltier multicellulaire, mais un est disponible dans le commerce auprès d'un fournisseur tiers (qCHANGER 6 de Quantum Northwest, environ 7 000 $ nouveau à partir de 2017). Ici, nous décrivons l'utilisation de la combinaison de ces deux instruments pour la collecte de données dans la dénaturation thermique UV-visible à spectre complet.

Une autre méthode courante de surveillance de la dénaturation thermique d'un échantillon d'ADN est la fluorescence. Ceci est systématiquement effectué dans les expériences qPCR, qui profitent souvent de la présence d'un colorant qui devient fluorescent en présence d'un duplex d'ADN, tel que SYBR Green ( Dorak, 2006 ). En mesurant la fluorescence en fonction de la température, une courbe de dénaturation thermique est obtenue. Nous utilisons régulièrement cette technique pour surveiller la stabilité de la structure secondaire des aptamères fluorescents (Fig. 2). L'utilisation de la fluorescence et/ou de l'absorbance associée au ligand permet d'observer à la fois la stabilité de la structure secondaire et la reconnaissance ARN-ligand dans la même expérience.

2 . L'aptamère contrôlé par fluorescence fond. L'aptamère du brocoli a une séquence de base étroitement liée à l'aptamère des épinards et à l'aptamère des bébés épinards modifiés, qui sont tous deux connus pour former des G-Quadruplexes ( Filonov, Moon, Svensen, &amp Jaffrey, 2014 Huang et al., 2014 Warner et al. ., 2014 ). Les fusions contrôlées par fluorescence du complexe Broccoli-DFHBI-1T montrent la dépendance cationique attendue de TM pour un G-Quadruplex (K + &gt Na + ⋙ Li + ). (A) Données de fluorescence. (B) Données traitées pour montrer dF/dT. Les données proviennent de la première trace de refroidissement. Les échantillons étaient dans 100 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM MCl avec M + comme spécifié dans la légende, 5 mM MgCl2.


Asie Pacifique

Le site sera affiché en anglais.

Nous utilisons ces cookies pour garantir que notre site fonctionne correctement et en toute sécurité, ils sont nécessaires au fonctionnement de nos services et ne peuvent pas être désactivés dans nos systèmes. Ils ne sont généralement définis qu'en réponse à des actions de votre part qui équivalent à une demande de services, telles que la connexion, l'utilisation d'un panier ou le remplissage de formulaires. Vous pouvez configurer votre navigateur pour bloquer ou vous alerter sur ces cookies, mais certaines parties de nos services ne fonctionneront pas sans eux. Comme les autres cookies que nous utilisons, les cookies strictement nécessaires peuvent être des cookies internes ou des cookies tiers.

Nous utilisons ces cookies pour mémoriser vos paramètres et préférences. Par exemple, nous pouvons utiliser ces cookies pour mémoriser vos préférences linguistiques.
Autoriser les cookies de préférence

Nous utilisons ces cookies pour collecter des informations sur la façon dont vous interagissez avec nos services et pour nous aider à les mesurer et à les améliorer. Par exemple, nous pouvons utiliser ces cookies pour déterminer si vous avez interagi avec une certaine page.
Autoriser les cookies de performance/statistiques

Nous et nos partenaires publicitaires utilisons ces cookies pour diffuser des publicités, pour les rendre plus pertinentes et significatives pour vous, et pour suivre l'efficacité de nos campagnes publicitaires, à la fois sur nos services et sur d'autres sites Web et réseaux sociaux.
Autoriser les cookies marketing


Regarder les spectres UV-vis

Nous avons parlé en termes généraux de la façon dont les molécules absorbent les UV et la lumière visible. Voyons maintenant quelques exemples réels de données provenant d'un spectrophotomètre d'absorbance UV-vis. La configuration de base est la même que pour la spectroscopie IR : un rayonnement avec une gamme de longueurs d'onde est dirigé à travers un échantillon d'intérêt, et un détecteur enregistre quelles longueurs d'onde ont été absorbées et dans quelle mesure l'absorption s'est produite.

Schéma d'un spectrophotomètre UV-Vis

Vous trouverez ci-dessous le spectre d'absorbance d'une importante molécule biologique appelée nicotinamide adénine dinucléotide, en abrégé NAD + . Ce composé absorbe la lumière dans la gamme UV en raison de la présence de systèmes de liaison pi conjugués.

Vous remarquerez que ce spectre UV est beaucoup plus simple que les spectres IR que nous avons vus précédemment : celui-ci n'a qu'un seul pic, bien que de nombreuses molécules en aient plus d'un. Notez également que la convention en spectroscopie UV-vis est de montrer la ligne de base au bas du graphique avec les pics pointant vers le haut. Les valeurs de longueur d'onde sur l'axe des x sont généralement mesurées en nanomètres (nm) plutôt qu'en cm -1 comme c'est la convention en spectroscopie IR.

Les pics des spectres UV ont tendance à être assez larges, s'étendant souvent bien au-delà de 20 nm à la hauteur mi-maximale. Typiquement, il y a deux choses que nous recherchons et enregistrons à partir d'un spectre UV-Vis. Le premier est (lambda_), qui est la longueur d'onde à l'absorbance lumineuse maximale. Comme vous pouvez le voir, NAD + a (lambda_ = 260 m). Nous voulons également enregistrer la quantité de lumière absorbée à (lambda_). Ici, nous utilisons un nombre sans unité appelé absorbance, abrégé 'A'. Celui-ci contient les mêmes informations que le nombre de « pourcentage de transmission » utilisé en spectroscopie IR, simplement exprimé en termes légèrement différents. Pour calculer l'absorbance à une longueur d'onde donnée, l'ordinateur du spectrophotomètre prend simplement l'intensité de la lumière à cette longueur d'onde avant il traverse l'échantillon (je0), divise cette valeur par l'intensité de la même longueur d'onde après il traverse l'échantillon (I), puis prend le journal10 de ce nombre :

Vous pouvez voir que la valeur d'absorbance à 260 nm (A260) est d'environ 1,0 dans ce spectre.

Exercice 4.11 :Exprimez A = 1,0 en termes de pourcentage de transmission (%T, l'unité habituellement utilisée en spectroscopie IR (et parfois aussi en UV-vis).

Voici le spectre d'absorbance du colorant alimentaire commun Red #3 :

Ici, nous voyons que le système étendu de liaisons pi conjuguées amène la molécule à absorber la lumière dans le domaine visible. Parce que le &lambda max de 524 nm tombe dans la région verte du spectre, le composé apparaît rouge à nos yeux. Maintenant, jetez un œil au spectre d'un autre colorant alimentaire, le Bleu #1 :

Ici, l'absorbance maximale est à 630 nm, dans la plage orange du spectre visible, et le composé apparaît en bleu.


Anneaux à six chaînons avec un hétéroatome et leurs dérivés carbocycliques fusionnés

7.02.2.5 Alcènes activés

Une préparation améliorée de précurseurs de colorants cyanines au moyen de l'addition 1,4 de pyridines et de quinoléines à l'acrylamide a été récemment décrite par Deligeorgiev (équations 3 et 4) <2005DP21>. La réaction du pyridinium 15 ou sel de quinolinium 17 dans l'acide acétique en présence d'une quantité catalytique de la base respective du substrat avec de l'acrylamide au reflux des sels produits 16 et 18 à bon rendement. Ces conditions ont permis de conduire la réaction en l'absence d'eau. Dans tous ces cas, l'acide acétique ne sert pas seulement de solvant mais inhibe plutôt efficacement la polymérisation de l'acrylamide.


RÉACTION EN CHAÎNE DE POLYMÉRASE

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique robuste pour amplifier sélectivement un segment spécifique d'ADN in vitro.[1] La PCR est réalisée sur thermocycleur et implique trois étapes principales : (1) la dénaturation de la matrice d'ADNdb à 92 ° ° 201395 ° ° 00b0C, (2) l'annelage des amorces à 50 ° ° 201370 ° ° ° 000b0C et (3) l'extension de l'ADNdb. molécules à env. 72ଌ. Ces étapes sont répétées pour 30� cycles.

Divers composants chimiques de la PCR incluent le MgCl2, tampon (pH : 8.3𠄸.8), désoxynucléoside triphosphates (dNTP), amorces PCR, ADN cible et ADN polymérase thermostable.[2]

Séquence cible est la séquence dans la matrice d'ADN, qui sera amplifiée par PCR.[2]

Amorces PCR sont de l'ADN simple brin (généralement 18 nucléotides de long), qui correspondent aux séquences aux extrémités ou à l'intérieur de l'ADN cible, et celles-ci sont nécessaires pour démarrer la synthèse d'ADN en PCR.[2]


Résumé

Les molécules d'ADN double brin fluorescent (ADNdb) marquées aux deux extrémités sont généralement produites par annelage de molécules d'ADN simple brin (ADNsb) complémentaires, marquées avec des colorants fluorescents à la même extrémité (3' ou 5'). Étant donné que l'efficacité de marquage de l'ADNsb est inférieure à 100 %, les ADNdb résultants en ont deux, un ou sont sans colorant. Les méthodes existantes sont insuffisantes pour mesurer le pourcentage du composant ADNdb doublement marqué dans l'échantillon d'ADN fluorescent et il est même difficile de distinguer le composant ADN doublement marqué du composant simplement marqué. Une mesure précise du pourcentage d'un tel composant d'ADNdb doublement marqué est une condition préalable essentielle pour les mesures biochimiques quantitatives, ce qui a intrigué les scientifiques pendant des décennies. Nous avons établi un système de spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) pour mesurer le pourcentage d'ADNdb doublement marqué (PDL) dans le pool d'ADNdb fluorescent total. La méthode est basée sur une analyse comparative de l'échantillon donné et d'un échantillon d'ADNds de référence préparé en ajoutant une certaine quantité d'ADNss non marqué dans la solution d'ADNss d'origine. A partir des fonctions d'autocorrélation FCS, nous obtenons le nombre de molécules d'ADNdb fluorescentes dans le volume focal du microscope confocal et du PDL. Nous calculons également l'efficacité d'étiquetage de l'ADNsb. La méthode nécessite une quantité minimale de matériel. Les échantillons ont une concentration d'ADN de l'ordre du nanomolaire/L et un volume de dizaines de microlitres. Nous vérifions notre méthode en utilisant l'enzyme de restriction Hind III pour cliver l'ADNdb fluorescent. La cinétique de la réaction dépend fortement du PDL, un paramètre critique pour les mesures biochimiques quantitatives.


Résultats

L'ATP se lie au RRM à des concentrations physiologiquement pertinentes

Ici, pour évaluer si l'ATP (Fig. 1a) interagit avec le domaine FUS RRM (Fig. 1b), nous avons acquis des spectres bidimensionnels de cohérence quantique unique (HSQC) 1 H-15 N RMN du FUS RRM marqué au 15 N. domaine à 40 µM dans du tampon phosphate de sodium 10 mM contenant 150 mM de NaCl (pH 6,8), titré avec de l'ATP à 14 concentrations allant de 0 à 40 mM. En superposant les spectres HSQC en présence d'ATP à différentes concentrations, nous avons constaté que seul un petit ensemble de pics HSQC présentait un changement significatif lors de l'ajout progressif d'ATP avec une concentration allant jusqu'à 40 mM (Fig. 2a et Fig. 1 supplémentaire). Avec notre précédente affectation séquentielle 14, nous avons réussi à cartographier la différence de déplacement chimique (CSD) des résidus entre l'état libre et ceux en présence d'ATP à différentes concentrations (Fig. 2b). Fait intéressant, seuls 10 résidus situés sur cinq régions de la séquence FUS RRM ont de grands décalages, avec des valeurs CSD > 0,065 (la valeur moyenne + un écart type). Ces résidus comprennent Asn284, Asn285, Val289, Thr313, Asn314, Thr326, Arg328, Thr338, Thr370 et Arg371. À en juger par les traces CSD des 10 résidus (Fig. 2c), la liaison de l'ATP au FUS RRM est largement saturée à 40 mM, suggérant ainsi que l'ATP interagit spécifiquement avec le domaine FUS RRM 15,16,17. En conséquence, nous avons obtenu avec succès les valeurs de constante de dissociation (Kd) spécifiques aux résidus de 10 résidus en ajustant les traces de CSD au modèle de liaison à un site 15,16,17. De manière frappante, les valeurs de Kd vont de 3,04 mM d'Asn284 à 4,43 mM de Thr370 (Fig. 2c), avec la valeur moyenne de Kd pour les 10 résidus de 3,77 ± 0,49 mM. Ce résultat indique donc que l'ATP est capable de se lier spécifiquement au domaine FUS RRM à des concentrations physiologiquement pertinentes d'ATP qui vont de 1 à 12 mM 1,2,3.

Structure chimique de l'adénosine triphosphate (ATP) et structure tridimensionnelle du motif de reconnaissance d'ARN FUS (RRM). une Structure chimique de l'ATP, de l'AMP et de l'acide triphosphate (PPP). Inlet : un modèle de bande dessinée de l'ATP montrant sa chaîne triphosphate, qui est très polaire et chargée négativement, et un cycle aromatique relativement hydrophobe d'adénine base lié par un ribose. b 526résidus FUS est composé de : région N-terminale à faible complexité de séquence (LC) (1–267) comprenant un domaine de type prion (PLD) riche en QGSY et une région riche en RG/RGG (RGG1) RRM (285– 370) et CTD de domaine C-terminal (371-526) qui contient une région riche en RG/RGG (RGG2), un doigt de zinc (ZnF) et une autre région riche en RG/RGG (RGG3) portant un signal de localisation nucléaire ( NLS). Le domaine RRM adopte un pli RRM typique composé d'une feuille à quatre brins et de deux hélices perpendiculaires, qui peuvent s'auto-assembler spontanément en fibrilles amyloïdes

L'adénosine triphosphate (ATP) se lie spécifiquement au motif de reconnaissance de l'ARN FUS (RRM). une Spectres de cohérence quantique simple hétéronucléaire par résonance magnétique nucléaire (RMN) 1 H-15 N du FUS RRM marqué au 15 N en l'absence et en présence d'ATP à différentes concentrations. Les pics fortement décalés sont étiquetés. b Différence de déplacement chimique (CSD) spécifique au résidu de FUS RRM en présence d'ATP à 10 mM (bleu), 30 mM (vert) et 40 mM (rouge). Les résidus fortement décalés sont marqués, qui sont définis comme ceux avec les valeurs CSD à 40 mM d'ATP > 0,065 (valeur moyenne + un écart type) (ligne violette). c Ajustement de la constante de dissociation (Kd) spécifique à 10 résidus : valeurs expérimentales (points) et ajustées (lignes) pour les CSD induites par l'ajout d'ATP à différentes concentrations. Les expériences de titrage RMN présentées ici ont été réalisées une fois

Exigence structurelle pour que l'ATP lie spécifiquement RRM

En raison de l'affinité de liaison extrêmement faible, il est impossible de déterminer la structure tridimensionnelle du complexe ATP-RRM par spectroscopie RMN classique ou cristallographie aux rayons X. Par conséquent, pour visualiser sa structure, nous avons effectué l'amarrage moléculaire par le programme HADDOCK bien établi 19 avec les contraintes RMN dérivées des titrages HSQC comme nous l'avons précédemment effectué sur le complexe de petites molécules EphA4 20. La figure 3 présente le modèle d'amarrage à plus faible énergie du complexe ATP-RRM. Comme on le voit sur les figures 3a, b, l'ATP se lie à une poche constituée des 10 résidus avec des pics HSQC fortement décalés (CSD > 0,065). Tous les dix résidus sont situés sur les terminaisons N et C et les boucles, à l'exception de Val289 situé dans le premier brin et Thr338 dans le troisième brin . Fait intéressant, les atomes d'oxygène de la chaîne triphosphate de l'ATP établissent respectivement deux liaisons hydrogène avec les protons de la chaîne latérale Asn323 et Thr338 (Fig. 3c). Un examen plus approfondi a révélé que le cycle aromatique de l'ATP est situé dans une poche du domaine FUS RRM avec la surface relativement hydrophobe (Fig. 3d, e), et il est intéressant de noter que le cycle aromatique de l'ATP est également en contact direct avec la chaîne latérale d'Arg328. , probablement par l'interaction –cation 21,22 . D'autre part, la chaîne triphosphate de l'ATP semble être intégrée dans une poche du domaine FUS RRM avec la surface chargée négativement (Fig. 3d, e) par interaction électrostatique.

Modèle tridimensionnel du complexe adénosine triphosphate (ATP)-ARN-recognition motif (RRM). une La structure en ruban du domaine FUS RRM du complexe ATP-RRM. b Le modèle d'amarrage à plus faible énergie du complexe ATP-RRM. La structure du FUS RRM est affichée en ruban, tandis que l'ATP est en bâtonnets. Les dix résidus avec de grandes valeurs CSD sont affichés dans des sphères et étiquetés. c Le modèle complexe ATP-RRM montrant deux liaisons hydrogène (en pointillés jaunes) entre la chaîne triphosphate d'ATP et les chaînes latérales d'Asn323 et Thr338 de FUS RRM respectivement. e Le modèle complexe ATP-RRM avec la structure RRM affichée dans la surface de potentiel électrostatique et l'ATP en bâtonnets

Sur la base du modèle du complexe ATP-RRM (Fig. 3), le cycle aromatique de l'adénine et la chaîne triphosphate de l'ATP semblent contribuer à l'interaction avec les résidus FUS RRM. Pour confirmer cette observation, nous avons en outre effectué des titrages RMN HSQC avec AMP et PPP, car l'adénosine a une faible solubilité et, par conséquent, elle n'a pas pu atteindre les concentrations élevées requises pour interagir avec le domaine FUS RRM. Fait intéressant, l'AMP a également été capable d'induire de grands décalages d'un petit ensemble de pics HSQC du domaine FUS RRM (Fig. 2 supplémentaire). Une analyse détaillée a révélé que l'AMP a un schéma similaire de CSD (Fig. 4a) que l'ATP (Fig. 2b) à l'exception du fait que les pics HSQC de Thr313, Asn314 et Thr338 n'ont plus de grands décalages. Ce résultat est tout à fait cohérent avec le modèle d'amarrage du complexe ATP-RRM dans lequel la chaîne triphosphate interagit directement avec Thr313, Asn314 et Thr338 (Fig. 3b). En tant que tel, l'élimination de deux groupes phosphate entraîne la perte d'interaction avec les résidus Thr313, Asn314 et Thr338 du domaine FUS RRM (Fig. 4b). D'autre part, nous avons augmenté la concentration d'AMP à 60 mM et obtenu par la suite les constantes de dissociation de 7 résidus avec les valeurs HSQC CSD >0,085, qui vont de 14,84 mM d'Arg371 à 21,82 mM d'Arg328 (Fig. 4c), avec la valeur moyenne de Kd de 17,24 ± 2,61 mM, montrant que par rapport à l'ATP, l'AMP a

Réduction de 5 fois de l'affinité de liaison au domaine FUS RRM.

L'AMP se lie au motif de reconnaissance d'ARN FUS (RRM) avec une faible affinité. une Différence de déplacement chimique (CSD) spécifique au résidu de FUS RRM en présence d'AMP à 10 mM (bleu), 50 mM (vert) et 60 mM (rouge). Les résidus largement décalés sont marqués, qui sont définis comme ceux avec les valeurs CSD à 60 mM d'ATP > 0,085 (valeur moyenne + un écart type) (ligne violette). b La structure du modèle complexe adénosine triphosphate (ATP)-RRM dans lequel seuls les résidus largement perturbés par l'AMP sont affichés dans des sphères. Le cycle rose est utilisé pour indiquer deux groupes phosphate de l'ATP mais absents de l'AMP. c Ajustement de sept constantes de dissociation (Kd) spécifiques aux résidus : valeurs expérimentales (points) et ajustées (lignes) pour les CSD induites par l'ajout d'AMP à différentes concentrations. Les expériences de titrage par résonance magnétique nucléaire présentées ici ont été réalisées une fois

En outre, nous avons également effectué les titrages avec PPP et les résultats ont montré qu'il n'induit que de grands décalages des pics HSQC de quatre résidus, y compris Thr313, Asn314, Met321 et Thr370 avec leur HSQC CSD > 0,06 (Fig. 5a et Fig. 3 supplémentaire). . Les valeurs Kd des quatre résidus ont été ajustées pour aller de 8,25 mM de Met321 à 16,82 mM de Thr370 (Fig. 5b), avec la valeur moyenne de 12,63 ± 3,53 mM, impliquant

Réduction de 3 fois de l'affinité pour le domaine FUS RRM par rapport à l'ATP. Ce résultat est également en accord général avec le modèle d'amarrage dans lequel le cycle aromatique assure le contact direct avec Thr326 et Arg328. D'autre part, il apparaît qu'en raison d'un volume moléculaire ou/et d'une affinité de liaison largement réduits par rapport à l'ATP, le PPP isolé a une légère réorientation de la liaison. Par conséquent, PPP n'induit aucun décalage significatif de Asn284, Asn285 et Thr338 mais déclenche le grand décalage d'un nouveau résidu Met321 avec son HSQC CSD > 0,06 (figure 5c).

L'acide triphosphate (PPP) se lie au motif de reconnaissance de l'ARN FUS (RRM) avec une faible affinité. une Différence de déplacement chimique (CSD) spécifique aux résidus de FUS RRM en présence de PPP à 10 mM (bleu), 50 mM (vert) et 60 mM (rouge). Les résidus largement décalés sont marqués, qui sont définis comme ceux avec les valeurs CSD à 60 mM PPP > 0,06 (valeur moyenne + un écart type) (ligne violette). b Ajustement de quatre constantes de dissociation (Kd) spécifiques aux résidus : valeurs expérimentales (points) et ajustées (lignes) pour les CSD induites par l'ajout de PPP à différentes concentrations. c La structure du modèle complexe adénosine triphosphate (ATP)-RRM dans lequel seuls les résidus largement perturbés par PPP sont affichés dans des sphères. Le cycle rose est utilisé pour indiquer l'adénosine de l'ATP mais absente dans le PPP. Les expériences de titrage par résonance magnétique nucléaire présentées ici ont été réalisées une fois

Les résultats du titrage RMN HSQC avec ATP, AMP et PPP prennent en charge le modèle d'amarrage du complexe ATP-RRM, indiquant que l'ATP se lie spécifiquement au domaine FUS RRM. De plus, l'affinité de liaison relativement élevée de l'ATP nécessite la présence à la fois d'une chaîne adénine et d'une chaîne triphosphate. L'AMP et le PPP isolés ont non seulement une affinité de liaison beaucoup plus faible, mais ont également une surface de contact réduite sur le domaine FUS RRM. Cependant, à en juger par le fait que la valeur moyenne de Kd de l'ATP est beaucoup plus grande que le produit des valeurs moyennes de Kd de l'AMP et du PP, il semble que les événements de liaison de la chaîne adénine et triphosphate au FUS RRM peuvent ne pas être indépendants 23 .

Les sites de liaison à l'ATP et aux acides nucléiques se chevauchent

Jusqu'à présent, aucune RMN ou structure cristalline n'a été déterminée avec succès pour le domaine FUS RRM en complexe avec des acides nucléiques. Cependant, il est bien établi que les domaines RRM des hnRNP partagent les interfaces de liaison bien conservées avec les acides nucléiques 11,12,13, comme le démontrent les structures cristallines du TDP-43 RRM1 (Fig. supplémentaire 4A) et RRM2 (Supplementary Fig. 4B) domaines en complexe avec différents ssDNA 24,25. Fait intéressant, l'ATP se lie au même côté du domaine FUS RRM (Fig. 3) et avec une partie de la surface de liaison chevauchant même les molécules d'ADN simple brin de liaison au site. En outre, le motif CSD du domaine FUS RRM induit par la liaison de l'ATP ici (Fig. 2b) partage une grande similitude avec ceux induits par la liaison de l'ARN et de l'ADN simple brin rapportés précédemment 13 . En bref, l'ARN et l'ADNsb ont également déclenché les modèles CSD similaires avec des résidus hautement décalés situés sur les cinq mêmes régions du domaine FUS RRM induites par l'ATP ici, bien que davantage de résidus aient des pics HSQC fortement décalés lors de la liaison des acides nucléiques 13 .

Par conséquent, nous avons posé la question de savoir si la pré-liaison de l'ATP au domaine FUS RRM perturberait sa liaison aux acides nucléiques. Pour résoudre ce problème, nous avons sélectionné un ligand fonctionnel, à savoir le TssDNA 24-mer, dont la liaison au domaine FUS RRM a été précédemment caractérisée comme un processus d'échange intermédiaire dans l'échelle de temps RMN 13 . Pour ce processus de liaison, l'ajout progressif de TssDNA induit le grand élargissement des pics HSQC et par conséquent conduit à la disparition des pics HSQC à des concentrations élevées de TssDNA 13 . En tant que tel, si la pré-liaison de l'ATP avec le domaine FUS RRM améliore largement la liaison du domaine FUS RRM au TssDNA, le processus de liaison devrait passer à un processus d'échange lent avec deux ensembles de pics HSQC : état et un autre de l'état complexé. En revanche, si la pré-liaison de l'ATP réduit largement la liaison du domaine FUS RRM au TssDNA, le processus de liaison devrait passer à un processus d'échange rapide avec les pics HSQC qui se déplacent progressivement lors de l'ajout progressif de TssDNA comme nous l'avons actuellement observé. sur le processus de liaison entre le domaine FUS RRM et l'ATP (Fig. 2a).

Ici, nous avons d'abord acquis les spectres HSQC du domaine FUS RRM marqué au 15 N titré avec TssDNA à des rapports molaires de 1:0,25, 1:0,5, 1:1, 1:2,5, 1:5 et 1:10 (RRM:TssDNA ). En effet, l'ajout de TssDNA a induit un élargissement spectaculaire des pics HSQC, et au rapport de 1:10, presque tous les pics HSQC du squelette ont disparu en raison de l'élargissement (Fig. 6a). Par la suite, nous avons préparé un autre échantillon du domaine FUS RRM marqué au 15 N dans les mêmes conditions à l'exception d'un ajout supplémentaire d'ATP à 3 mM, qui imitent la concentration d'ATP dans les neurones (

3 mM), qui a été titré avec TssDNA aux mêmes six rapports. Les spectres obtenus avec l'ATP à 3 mM (Fig. 6b) n'ont montré aucune différence importante par rapport à ceux sans ATP (Fig. 6a). The results indicated that the presence of ATP failed to shift the binding event with TssDNA into either slow or fact exchange process, thus suggesting that the pre-binding of ATP would not dramatically perturb the binding process of the FUS RRM domain to its functional ligand TssDNA. This is reasonable as the Kd of the binding of the FUS RRM domain to ssDNA is

23 µM 13 . In other words, the binding affinity of the FUS RRM domain to TssDNA is

164 times higher than that to ATP.

Adenosine triphosphate (ATP) has no large perturbation on the binding of RNA-recognition motif (RRM) with telomeric single-stranded DNA (TssDNA). une Heteronuclear single quantum coherence (HSQC) spectra of FUS RRM upon addition of 24-mer human TssDNA at different ratios. b HSQC spectra of FUS RRM with the pre-existence of 3 mM ATP upon addition of TssDNA at different ratios. The nuclear magnetic resonance titration experiments presented here were performed once

We also attempted to explore whether ATP can bind other well-folded proteins. To assess this, we collected HSQC spectra of the 15 N-labeled human profilin-1 (PFN1) titrated with ATP at different concentrations (Supplementary Fig. 4C). PFN1 is an 140 residue small protein that regulates actin polymerization, and a list of mutations have been identified to cause ALS 26,27,28 . It adopts a well-structured globular fold 27 , in which a seven stranded β-sheet is sandwiched by N- and C-terminal α-helices on one face of the sheet and three small helical regions on the opposite face (Supplementary Fig. 4D). Previously, we have conducted extensive NMR studies on PFN1 and its ALS-causing mutants 28 . As shown in Supplementary Fig. 4C, even with ATP concentrations reaching up to 20 mM, only two HSQC peaks from the exposed residues H120 and Gly121 (Supplementary Fig. 4D) showed some shifts. This result indicates that not all well-folded proteins have the specific ATP-binding pocket as identified on the FUS RRM domain.

ATP kinetically inhibits amyloid formation

The FUS RRM domain is required for its cytoxicity and indeed we previously found that it could spontaneously self-assemble into amyloid fibrils 14 . Therefore, here we aimed to assess whether ATP binding has effect on the fibrillation of the FUS RRM domain. Previously, we monitored the process by circular dichroism (CD), fluorescence, and NMR spectroscopy, as well as electron microscopy (EM). However, as the presence of ATP in the sample gave rise to large non-specific noise over both far- and near-ultraviolet (near-UV) CD regions. Therefore, here we monitored the formation of amyloid fibrils by the FUS RRM domain by Thioflavin-T (ThT) binding induced fluorescence, NMR spectroscopy, microscopy, and EM under the same conditions except for extra addition of ATP at different concentrations. Previously, without the presence of ATP, only after 2 days, almost all HSQC peaks of the FUS RRM become largely broadened and after 4 days completely disappeared and the sample also become cloudy. On examination by microscopy, some condenses were formed that were further identified to be amyloid fibrils by EM 14 . Interestingly, here in the presence of ATP at 3 mM, even after 15 days NMR HSQC peaks showed no detectable disappearance only with minor shifts of several peaks (Supplementary Fig. 5A), and no ThT-binding induced fluorescence was detected (Supplementary Fig. 5B). Furthermore, the sample remained transparent, and no condense was observed as checked by microscopy. Furthermore, no amyloid fibrils were formed as imaged by EM (Supplementary Fig. 5C). This result indicates that the presence of ATP inhibits the FUS RRM domain to self-assemble into amyloid fibrils.

We thus attempted to understand whether inhibition of amyloid formation is due to the enhancement of thermodynamic stability. Previously, we have characterized the thermal unfolding of FUS RRM under different conditions as monitored by CD and fluorescence spectroscopy. The melting temperatures were determined to be

52–56 °C that is dependent on the probes (CD or fluorescence) used. As the presence of ATP resulted in large noises in both far- and near-UV CD regions, we planned to use the intrinsic UV fluorescence from residue Trp353 to report the thermal unfolding. Unexpectedly, we found that the addition of ATP led to dramatic quenching of the intrinsic UV fluorescence, and at 3 mM of ATP, the intrinsic UV fluorescence became very weak (Fig. 7a). We thus measured the Trp intrinsic UV fluorescence of several well-folded proteins, including PFN1 and TDP-43 RRM domains, and found that universally ATP could almost completely quench their intrinsic UV fluorescence at concentrations >4 mM. As such, we decided to monitor the thermal unfolding by a very popular method called differential scanning fluorimetry (DSF). Briefly, the thermal unfolding transition of a protein in the presence of a fluorescent dye SYPRO Orange is utilized to reflect the thermodynamic stability of a protein 29 . This dye with its fluorescence quenched in an aqueous solution becomes highly fluorescent in non-polar environments. As such, when a protein becomes unfolded, this dye will bind to the exposed hydrophobic patches of the unfolded intermediates, thus leading to a dramatic increase in visible fluorescence 29 .

Adenosine triphosphate (ATP) has no detectable effect on thermodynamic stability of RNA-recognition motif (RRM). une Intrinsic ultraviolet (UV) fluorescence spectra from residue Trp353 of FUS RRM in the presence of ATP at different concentrations. The fluorescence intensity was reported in arbitrary unit. b Differential scanning fluorimetric melting curves of thermal unfolding of FUS RRM in the presence of ATP at different concentrations by plotting the first derivative of the fluorescence emission as a function of temperature (−dF/dT). Here the Tm is represented as the lowest point of the curve. c A proposed diagram to illustrate that the specific ATP binding kinetically inhibit the self-assembly into amyloid fibrils without large alteration of the thermodynamic stability of FUS RRM. These data represent one out of three experiment repeats with similar results

Figure 7b presents the melting curves of the FUS RRM domain in the presence of ATP at different concentrations, showing that the unfolding of the RRM domain by increasing temperatures is accompanied by increase in SYPRO Orange fluorescence. The melting temperature (Tm) values were determined by plotting the first derivative of the fluorescence emission as a function of temperature (−dF/dT). The FUS RRM domain in the absence of ATP has a Tm of

55 °C, consistent with our previous results determined by CD and fluorescence probes 14 . Interestingly, the presence of ATP with concentrations up to 20 mM does not have any detectable effect on Tm values of the FUS RRM domain, suggesting that ATP binding has no large alteration of the thermodynamic stability. On the other hand, however, it is interesting to note that the dF/dT values at Tm increased upon increasing ATP concentrations, implying that the hydrophobic patches exposed during unfolding may have different properties or/and degrees in the presence of ATP at different concentrations. We have also assessed the thermal unfolding of the full-length FUS with ATP at different concentrations but the obtained curves appeared to be very complex (Supplementary Fig. 5D). The full-length FUS additionally contains a folded zinc finger with

30 residues and particularly a large portion (

75%) of the intrinsically disordered regions (Fig. 1b). While the new transition at

38 °C might result from the unfolding of the folded zinc finger, the transition of the RRM domain was covered by a large increase of –dF/dT over 50–60 °C. This increase might be due to the temperature-dependent binding/release of the dye interacting with the hydrophobic patches over the intrinsically disordered region. In particular, the PLD over residues 1–165 contains many hydrophobic/aromatic residues, which are accessible for interacting with the dye even in the native state. As such, it is almost impossible to interpret the exact effect of ATP on the thermal stability of the full-length FUS.


QUANTITATION WITH A SPECTROPHOTOMETER

Use H2O or 1X TE as a solvent to suspend the nucleic acids, and place each sample in a quartz cuvette. Zero the spectrophotometer with a sample of solvent. For more accurate readings of the nucleic acid sample of interest, dilute the sample to give readings between 0.1 and 1.0.

For a 1-cm pathlength, the optical density at 260 nm (OD260) equals 1.0 for the following solutions:

a 50 μg/mL solution of dsDNA

a 33 μg/mL solution of ssDNA

a 20-30 μg/mL solution of oligonucleotide

a 40 μg/mL solution of RNA

Contamination of nucleic acid solutions makes spectrophotometric quantitation inaccurate. Calculate the OD260/OD280 ratio for an indication of nucleic acid purity. Pure DNA has an OD260/OD280 ratio of

1.8 pure RNA has an OD260/OD280 ratio of

2.0. Low ratios could be caused by protein or phenol contamination.

Example of Calculation

A sample of dsDNA was diluted 50X. The diluted sample gave a reading of 0.65 on a spectrophotometer at OD260. To determine the concentration of DNA in the original sample, perform the following calculation:

dsDNA concentration = 50 μg/mL × OD260 × dilution factor

dsDNA concentration = 50 μg/mL × 0.65 × 50

dsDNA concentration = 1.63 mg/mL


Afrique

André de Villiers , . Hélène H. Nieuwoudt , in Analytica Chimica Acta , 2012

4.1 Regulatory analyses

Despite the extreme complexity of wine, only a few chemical compounds are typically regulated in wine legislation. Regulated wine parameters include alcohol content, reducing sugars, volatile acidity and sulphur dioxide. Analytical procedures for determining these regulated parameters are mostly official methods prescribed by the International Vine and Wine Office (OIV) and are frequently classical wet chemistry methods characterised by high robustness and precision and low cost (the latter is an important consideration in many wine laboratories). Alternative procedures utilizing modern, automated instrumental techniques, which provide high sample throughput, sensitivity, selectivity and precision, may also be applied for regulatory analyses. However, for these methods to be endorsed by the OIV, a systematic comparison with the official reference method is mandatory to ensure suitability [167,168] . In the following sections, a brief overview of the official methods used for regulatory purposes will be presented. Where relevant, more modern methods reported by African scientists will be discussed in more detail.

4.1.1 Alcohol content

The alcohol content of wine is an important parameter that is universally displayed on wine labels and which factors in the calculation of excise duty in commerce. The alcohol content of different types of wine is legislated in many countries. The determination of the wine alcohol therefore needs to be accurate and precise as tolerances in the order of 0.5–1.0% of the documented value are typically enforced. Procedures for the determination of wine alcohol content may be divided into methods that measure the physical characteristics of a solution (typically the distillate of a wine) and those based on the chemical properties of alcohol. Chemical methods include dichromate oxidation and enzymatic determination, whilst physical methods use specific gravity or boiling point depression. The official OIV method uses specific gravity for wine alcohol determination [167] . Instrumental methods such as HPLC and GC may also be used [169] . Fletcher and van Staden [170] described an automated sequential injection analysis technique utilizing dichromate oxidation and spectrophotometric detection for the determination of ethanol in distilled liquors. Recently, the suitability of rapid, multi-component non-specific NIR spectroscopic methods for alcohol has been demonstrated. These methods rely on extensive calibration protocols to ensure accuracy [14,15,40] .

4.1.2 Volatile acidity

Volatile acidity is defined as the content of those wine acids which may readily be removed by steam distillation. Volatile acidity is an indicator of wine spoilage and is therefore regulated as a quality assurance parameter. Spoilage may result from bacterial action such as caused by acetic acid bacteria or spoilage yeasts, such as Brettanomyces. Since extrinsic factors may also play a role in development of volatile acids (for example in some dessert wines), specific legal limits are often dependent on the class or style of the wine [94,169] . The OIV prescribes steam distillation and titrimetry as the reference method for volatile acidity [167] . Enzymatic and flow injection methods as well as HPLC, GC and NIR spectroscopic methods have also been described for this purpose [14,15,168,169] .

4.1.3 Sulphur dioxide

Sulphur dioxide is widely used in the wine industry as a chemical preservative and inhibitor of microbiological activity as well as an antioxidant to reduce chemical and enzymatic browning. Due to its negative sensory properties and adverse health effects, the sulphur dioxide content of wines is regulated. Sulphur dioxide can exist in inter-convertible free and bound states, the regulated levels of which vary depending on the type and style of wine as well as between bulk and bottled wines [94,169] . The official OIV analysis method involves oxidation of separated sulphur dioxide followed by titremetry. Free and total sulphur dioxide are separately determined in this way by entrainment at low temperature and high temperature, respectively. Titration with iodine may be used as a rapid alternative method, although this procedure is known to be inaccurate. Instrumental methods described for sulphur dioxide analysis include flow injection analysis, enzymatic analysis, HPLC, GC, potentiometry and polarography, ultraviolet and visible spectrophotometry, atomic absorption and fluorometric spectrometry as well as NIR spectroscopic methods [14,169] .

4.1.4 Reducing sugars

The principal sugars utilized by yeast in alcoholic fermentation are glucose and fructose, referred to as reducing sugars as they are capable of reducing copper (as Cu(II)), a characteristic which is used in their analysis. The reducing sugar content is an important regulatory parameter that is used to classify wine styles [94] . Analytically, reducing sugars may be determined by chemical, enzymatic, flow injection analysis and HPLC [97] techniques, whilst GC may also be utilized following derivatization [168,171] . NIR spectroscopic methods for the determination of reducing sugars have also been described [14,15] . The official OIV method is based on the reduction of Cu(II) in boiling alkaline medium and determination of the remaining copper. In wine styles where the addition of sugar (usually sucrose) to the finished product is allowed, such as sparkling wines, these are subjected to a preliminary acid hydrolysis to convert disaccharides to their component reducing sugars [167] . Chaptalization (pre-fermentation addition of sugar) is typically illegal in warmer growing conditions such as encountered in Africa, where grapes usually develop adequate sugar levels. The addition of sucrose to the must can only be detected with stable isotope analysis since complete hydrolysis of sucrose at normal wine pH levels is expected in the finished product [94] .

4.1.5 Heavy metals

Many minerals are found in wine and in most instances these reflect uptake characteristics of the rootstock and climatic influences on the rate of transpiration. Since heavy metals typically precipitate during fermentation, their elevated occurrence in finished wine is usually associated with contamination after fermentation [94] . Heavy metals are determined in wine with spectrophotometric and spectroscopic techniques. Due to the low maximum levels that are typically enforced for toxic elements, specialized techniques such as graphite furnace atomic absorption spectroscopy (AAS) (for Pb and Cd) and hydride generation AAS (for As and Hg) are prescribed by the OIV. Flame AAS methods are used for elements such as copper, iron and tin, for which relatively high maximum levels are typically enforced [167] . Onianwa et al. [43] successfully applied flame AAS for the determination of various metals, including lead and cadmium, in non-alcoholic wines using suitable sample mineralization and pre-concentration techniques. Inductively coupled plasma emission spectroscopy (using both optical and mass spectrometric detection) may also be used for multi-element analysis. Dessuy et al. [44] developed and validated a method for the determination of lead in wine using electrothermal AAS. The use of various chemical modifiers was investigated and palladium was found to produce optimal stabilization of lead during pyrolysis. The optimised procedure enabled the determination of lead in wine without any sample preparation with a limit of detection of 0.5 μg L −1 . Since this procedure is fully automated and sufficiently sensitive, it is suited for routine regulatory determination of lead in wines.

4.1.6 Preservatives

Antimicrobial agents are used to confer microbial stability to wine, the most frequently used being sulphur dioxide. Other preservatives such as sorbic acid, benzoic acid, dimethyl dicarbonate and natamycin are also allowed. Of these preservatives only sulphur dioxide and dimethyl dicarbonate possess reasonable wide-spectrum antimicrobial properties, whilst natamycin is prohibited in some countries (notably the EU). Dimethyl dicarbonate can effectively sterilize wine if used just before bottling. This compound decomposes rapidly to carbon dioxide and methanol and therefore produces no sensory defect or residue. However, it has low solubility and is corrosive and therefore requires expensive equipment for effective application. Sorbic acid and benzoic acid (or their sodium salts) generally have low effectiveness and produce negative sensory effects at higher concentrations. Their use is therefore subject to legislated maximum allowable concentrations [94] . Sorbic acid and benzoic acid may be determined with spectrophotometry, but are more often analysed in wine by HPLC with UV-visible detection [169] . For example, at the National Department of Agriculture in South Africa, sorbic acid in wine is determined by direct injection RP-LC-UV utilizing ion pairing or an acidic mobile phase to optimise chromatographic efficiency. UV detection at ∼260 nm confers sufficient selectivity to the technique to yield detection limits in the low mg L −1 range. Natamycin at its effective concentrations may also be determined in wine using HPLC with UV-visible detection, but for demonstration of compliance with EU standards, more sensitive methodologies are required. Alberts et al. [172] recently described a simple, robust and fast LC-ESI-MS/MS method for the determination of natamycin in wine. Sample preparation involved dilution followed by direct elution from aminopropyl SPE cartridges. The application of mutually supporting sample pre-treatment and chromatographic separations to eliminate matrix-related ion suppression enabled quantitative determination of natamycin in wine with external standard calibration. This critical benefit rendered the method suitable for routine analysis of large numbers of samples in support of the wine export industry to the EU. The method complied with EU standards in terms of sensitivity and selectivity for this application and was also used to study the degradation kinetics of natamycin in the wine matrix (an important aspect from a regulatory point of view).

4.1.7 Methanol

Methanol is usually present in wine in relatively small quantities and never accumulates to toxic levels using legitimate winemaking procedures. In humans methanol is oxidised to formaldehyde and formic acid, both of which are toxic to the central nervous system. As methanol is derived from the pectin content of the fermentable substrate, red wines typically evolve more methanol than white wines, and pectolytic enzymes added to the juice or wine to aid clarification may further increase methanol levels. The addition of distilled spirits to wine, such as in fortified wines, may also affect the methanol content [94,169] . Wine methanol content is therefore typically regulated by legislation. Methanol is usually determined by GC-FID following quantitative distillation of the wine to eliminate non-volatile constituents.

4.1.8 Wine authenticity

Establishing conformity with laws and regulations governing the wine industry is often dependent on the development of sophisticated analysis techniques. Because of the wide range of possible adulteration practices and the complexity of wine, these methods are often specifically designed for each type of adulteration [94] . For example, de Villiers et al. [165] developed HPLC and CE methods for the analysis of the artificial dyes brilliant blue and azorubine in red wines. Liquid–liquid extraction followed by ion-pair liquid chromatographic analysis allowed separation of these dyes from wine polyphenols to achieve detection limits in the parts per billion range with reliable UV-spectral identification. On the other hand CE analysis following SPE sample clean-up provided higher efficiency, reduced solvent consumption and faster analyses for the same analyses [165] .